En 1787 llegó la Real Expedición Botánica a la Nueva España que además de hacer el inventario de flora y fauna del virreinato tuvo como objetivo la creación del Real Jardín Botánico del Palacio Virreinal de la Nueva España y su cátedra.

El Jardín fue planeado desde la Isla de Cuba por Martín Sessé en correspondencia con Casimiro Gómez Ortega, director del Real Jardín Botánico de Madrid. La cátedra de botánica estaría dirigida a estudiantes de medicina. Aunque la idea de Sessé era construir el Jardín Botánico en el Colegio de San Pedro y San Pablo, por distintas causas se tuvo que buscar otro espacio. La segunda opción fue el potrero de Atlampa junto al Paseo Bucareli, cerca del acueducto del Salto del Agua.

Al llegar Sessé a la Nueva España se puso en contacto con los intelectuales novohispanos como José Antonio Alzate para buscar materiales de la expedición de Francisco Hernández.  

El primer jardinero fue Jacinto López nombrado en 1790. Por las condiciones de humedad de Atlampa, se intentó cambiar el jardín a Chapultepec. Mientras el Chapultepec estaba listo, se hizo un Jardín "provisional" en el palacio virreinal bajo auspicios del virrey Revillagigedo. 

El Jardín se inició en 1799 dentro del Palacio Virreinal junto con un espacio para herbario, aula para lecciones y habitaciones para el catedrático. Sin embargo, después de la muerte del virrey, el Jardín fue perdiendo importancia. 

Alexander Von Humboldt y Aimé Bonpland, en su paso por México, visitaron el Jardín Botánico en su mejor época en 1803-1804, siendo virrey de Nueva España, José Joaquín Vicente de Iturrigaray y Aróstegui de Gaínza y Larrea. 

El curso de botánica, en manos de Vicente Cervantes (1775-1829), duraba entre cuatro y seis meses, con seis horas semanalmente. En el curso se impartía la reciente teoría de Linneo y el conocimiento sobre los usos de las plantas. Uno de los estudiantes sobresalientes en las cátedras de botánica fue Mariano Mociño, quien posteriormente se unió a la Real Expedición Botánica.

Miguel Bustamante (1790-1844) pupilo de Vicente Cervantes, se encargó de la dirección del Jardín después de la muerte de su maestro. A partir de 1831, Pablo de la Llave fue el responsable. Más tarde, hasta 1847 el Jardín compartió dirección con el Museo Nacional y con el Colegio de Minería.

Madame Calderón de la Barca visitó el Jardín en 1840 y comentó que el recinto estaba abandonado.